Odgovori na postavljena pitanja - Biologija

Postoje različiti načini bojanja bakterija koji ovise o tome što želimo ispitivati tj. vidjeti pod mikroskopom. Najšire korištena metoda bojanja bakterija je metoda bojanja po Gramu (Christian Gram 1884.). Postupak bojenja po gramu u literaturi je opisan u nekoliko varijacija, a ovdje ću ukratko navesti uobičajeni i najčešće korišteni postupak.

Da bi se dobili vjerni rezultati bojanja, bakterijska kultura ne smije biti starija od 24 sata, jer kod nekih bakterija gram-pozitivnost iščezava kod starijih kultura. Ukoliko se preparat za bojanje pripravlja iz bakterijske suspenzije, uzorak se uzima bakteriološkom ušicom i tanko razvuče po predmetnom stakalcu. Ukoliko se bakterije nalaze na krutoj podlozi, na predmetnicu se stavi kap destilirane vode s dodatkom 3% NaCl, bakteriološkom ušicom se uzme uzorak, prenese se u kap i razvuče se u tankom sloju na predmetnom stakalcu. Pripremljeni mokri preparati osuše se na sobnoj temperaturi ili uz slabiji izvor topline. Da se prilikom bojanja bakterije ne bi mehanički uklonile s predmetnog stakalca (oprale mlazom boje ili vode), preparat se učvršćuje (fiksira) provlačenjem kroz plamen ili se 10-15 minuta ostavlja u suhom sterilizatoru na 120 °C. Fiksiranje preparata plamenom vrši se tako da se predmetnica nekoliko puta provlači kroz plamen Bunsenova plamenika, tako da je preparat s gornje strane. Fiksirani preparati se zatim boje na tzv. stoliću za bojanje.

Za bojanje po Gramu preko cijelog preparata nanese se prva boja kristalviolet (karbol-gencijanaviolet) i ostavi 3 do 5 min. Boja se zatim fiksira lugolom (zasićena otopina joda u KI) 1 do 2 min. Preparat se dobro ispere 96%-tnim etalonom, sve dok ne poteče bistar etanol kako bi se uklonio suvišak kristalvioleta i lugola sa stanica koje nisu reagirale s tim bojama (gram-negativne) i iz međustaničnih prostora. Djelovanje etanola prekida se ispiranjem preparata pod mlazom vode. Naime, dugotrajnim ispiranjem etalonom uklonila bi se boja i s nekih starijih gram-pozitivnih stanica, koje su bile obojene kristalvioletom i lugolom, pa bismo na kraju, u preparatu dobili pogrešnu sliku. Ako su dakle, u preparatu bile gram pozitivne bakterije, one će nakon prvog dijela bojanja biti obojene plavo-ljubičasto. Ako su u preparatu bile i gram-negativne bakterije, one će nakon dodatka etanola i vode, odbojiti i ostati bezbojne. U daljnjem postupku, radi dokazivanja i gram-negativnih bakterija, nanosimo preko preparata kontrastnu crvenu boju safranin ili karbol-fuksin i ostavimo 0,5 do 1 minute. Nakon toga preparat se opere pod mlazom vode da bi se uklonila crvena boja iz staničnih međuprostora. Gram-negativne bakterije stoga će bit obojene u crveno.

Postupak bojanja po Gramu (I):

1. gentiana violet ili kristal violet 3-5 min
2. lugol 1-2 min
3. ispiranje etanolom
4. ispiranje vodom
5. karbol fuksin ili safranin 0,5-1 min
6. ispiranje vodom

Obojani preparat se osuši između filtar papira ili na zraku. Na preparat se doda kap imerzionog ulja (cedrovo ulje ili anisol) i mikroskopira pod imerzionim objektivom (povećanje 1000x).

Dr.sc. Jasna Hrenović
viši asistent na Botaničkom zavodu
Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb