120. Kako se mogu u školi dokazati bjelančevine,masti
i ugljikohidrati?
IV. gimnazija, Zagreb
Za dokazivanje bjelančevina koristi se više
karakterističnih obojenih reakcija, od kojih su najpoznatije sljedeće:
1. Biuretska reakcija je karakteristična za sve
bjelančevine jer ovisi o prisutnosti peptidnih veza (-CO-NH-). Pozitivnu
reakciju daju i polipeptidi od tripeptida na dalje. Ime je dobila po kondenzacijskom
produktu dviju molekula uree - biuretu - koji također daje
pozitivnu reakciju. Ova reakcija izvodi se tako da se alkalnoj
otopini bjelančevina dodaje minimalna količina
razrijeđene otopine bakrenog (II)-sulfata, pri čemu se
pojavljuje ružičasto ljubičasto obojenje.
2. Ksantoproteinska reakcija je karakteristična
za bjelančevine koje sadrže aromatske aminokiseline
(fenilalanin, tirozin i triptofan). Djelovanjem koncentrirane
nitratne kiseline na bjelančevine dolazi do nitriranja aromatskih
jezgara, pri čemu nastaju žuto obojeni aromatski spojevi. Dodatkom amonijaka
ovo žuto obojenje prelazi u narančasto.
3. Millonova reakcija je karakteristična
za aminokiselinu tirozin. Sastoji se u zagrijavanju bjelančevina
s Millonovom otopinom (otopina živinog nitrata, Hg(NO3)2 i živinog
nitrita, Hg(NO2)2 u nitratnoj kiselini). Ukoliko
bjelančevina sadrži tirozin, pojavit će se ciglasto crveni talog.
Ovaj talog nastaje djelovanjem žive na bjelančevine.
Sve navedene reakcije mogu se provoditi na sjemenkama ricinusa
(Ricinus communis). Sjemenke ricinusa se oljušte (oprezno, sjemenke
su otrovne zbog prisutnosti lektina ricina D), raspolove i
pojedinačne polovice stave na satna stakla
te se naprave sljedeće probe:
a) Biuretska reakcija: komadić endosperma se navlaži koncentriranom
otopinom kalijeve lužine i doda nekoliko kapi otopine bakrenog
(II)-sulfata. Endosperm će se obojiti ružičasto ljubičasto.
b) Ksantoproteinska reakcija: Na endosperm
se kapne kap koncentrirane nitratne kiseline. Satno staklo odmah
treba prekriti s drugim, obrnutim satnim staklom. Nakon što
se pojavi žuto obojenje, kapne se kap otopine amonijaka.
Žuto obojenje prelazi u narančasto.
c) Millonova reakcija: na usitnjeni endosperm kapne
se malo Millonovog reagensa. Pojavljuje se obojenje
crveno poput cigle. Reakcija se može ubrzati opreznim zagrijavanjem.
DOKAZIVANJE UGLJIKOHIDRATA
Za dokazivanje šećera karakteristične
su Fehlingova i Benedictova reakcija pri kojima se otopina
šećera zagrijava s Fehlingovim reagensom (vodena otopina bakrenog
sulfata, kalij-natrij tartarata i natrijevog hidroksida) ili s Benedictovim
reagensom (vodena otopina natrijevog karbonata, natrijevog citrata i bakrenog
sulfata). Naime, svi jednostavni šećeri imaju redukcijska svojstva zbog
?-ketol grupacije (karbonilna skupina uz hidroksilnu
skupinu). Ove reakcije zasnivaju se na redukciji dvovalentnog iona
bakra u jednovalentni (bakreni oksid, Cu2O) koji se izlučuje
kao crveni talog. Pri tom aldoze prelaze u karboksilnu kiselinu, a mogu
se, osobito u jako alkalnoj otopini, još dalje razgraditi.
Ketoheksoze se cijepaju na glikolaldehid i tetrozu, i tada se dalje
oksidiraju.
Ketoze i aldoze se mogu međusobno razlikovati na temelju kemijskih
svojstava. Općenito, aldoze se lakše oksidiraju od ketoza. Aldoze npr.
reduciraju ione Ag+ u elementarno srebro (srebrno zrcalo) a pri tome
se same oksidiraju u odgovarajuću kiselinu. Reakcija se događa u amonijakaličnoj
otopini srebrnog nitrata koja sadrži diaminosrebro-ione Ag(NH3)2+
.
Reakcije se mogu provesti s različitim ugljikohidratima, ali
i na biljnome materijalu, npr. plodu jabuke.
U jednoj epruveti u nekoliko kapi destilirane vode otopite malu
količinu saharoze, a u drugoj malu količinu glukoze, te u svaku epruvetu
dodajte jednake količine Benedictovog reagensa (3-4 kapi), promiješajte
potresanjem i oprezno ih istovremeno stavite u kipuću vodenu kupelj. Nakon
prve pojave naranđasto crvenkastog taloga, odmah izvadite obje epruvete
iz vodene kupelji i ohladite ih pažljivo pod mlazom vode. U epruveti s
glukozom pojavit će se naranđasto crvenkasti talog Cu2O, dok
se u epruveti sa saharozom talog ne stvara.
Otopite još malo glukoze u nekoliko kapi destilirane vode, dodajte
toj otopini nekoliko kapi amonijakalične otopine srebrnog nitrata i oprezno
zagrijavajte na plameniku (na malom plamenu) provlačenjem epruvete kroz
plamen. Na stijenkama epruvete stvorit će se srebrno zrcalo zbog redukcije
Ag+ u elementarno srebro.
Benedictova reakcija može se primijeniti u botaničkoj histokemiji.
Načinite prerez ploda jabuke srednje debljine (oko 0,5 mm), stavite ga
na predmetnicu, nakapajte Benedictov reagens, i oprezno zagrijte
na malom plamenu (predmetnicu oprezno provlačite kroz plamen). U tkivu
će se istaložiti naranđasto crvenkasti talog bakrenog (I)-oksida.
DOKAZIVANJE MASTI
Masti se mogu dokazati selektivnim bojanjem lipofilnim bojama
(npr. Sudan III). Zagrijavanjem masti s kalijevim hidrogensulfatom (KHSO4)
dolazi do termolize masti do glicerina i aldehida akroleina koji ima oštar
miris a može se dokazati reakcijama za dokazivanje aldehida (npr. redukcija
Ag+ do elementarnog srebra). U alkalnim otopinama masti se razgrađuju
do masnih kiselina i glicerola (saponifikacija). Nastanak masnih kiselina
dokazuje pojava mirisa po sapunu, a glicerol s bakrenim ionima (Cu2+)
daje plavo obojenje.
Pokus selektivnog bojanja izvodi se na sljedeći način: u dvije
epruvete stavi se po 1 ml ulja i 1 ml vode. Jednoj epruveti doda se nekoliko
kapi boje Sudan III, a drugoj malo crvene paprike u prahu (sadrži karotenoide).
Obje epruvete treba dobro protresti i kratko zakuhati te ostaviti da se
odvoje dvije faze. U oba slučaja lipidna faza će se obojiti, jer su Sudan
III i karotenoidi lipofilni, tj. otapaju se u mastima.
Pokus razgradnje masti u alkalnoj otopini izvodi se na sljedeći
način: u jednu epruvetu stavi se 1ml biljnoga ulja a u drugu 1 ml parafinskoga
ulja. U obje epruvete doda se po 4 ml 1%-tne otopine kalijeve lužine i
zagrije. Biljno ulje se razgrađuje, a otopina se pri protresanj pjeni dok
parafinsko ulje ne pokazuje promjene.
Prof.dr.sc. Branka Pevalek-Kozlina
Botanički zavod
Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb
bpevalek@public.srce.hr