Mikroskopi su instrumenti pomoću kojih možemo vidjeti povećane slike
malih predmeta. Da bi lakše razumjeli princip rada elektronskog mikroskopa
potrebno je najprije prisjetiti se na koji način radi svjetlosni mikroskop.
Svjetlosni mikroskopi za stvaranje povećane slike predmeta koriste snop
svjetlosti. Snop svjetlosti osvjetljava objekt koji promatramo te zatim
prolazi kroz optički sustav mikroskopa koji omogućuje stvaranje njegove
povećane slike. Optički sustav mikroskopa građen je od niza leća, a može
se podijeliti na dva osnovna dijela: okular i objektiv. Objektiv je građen
od sustava leća, a okrenut je prema predmetu (objektu) koji promatramo.
Kroz okular se gleda u mikroskop i također je građen od sustava leća.
Svjetlost kojom osvjetljavamo predmet prolazi kroz tzv. kondenzor
koji može biti građen od jedne ili više leća, a njegova je uloga da sabire
zrake svjetlosti na uzorku koji promatramo kako bi on bio što bolje osvjetljen.
Svjetlost zatim prolazi kroz uzorak i ulazi u leće objektiva koje stvaraju
prvu povećanu sliku predmeta. Leće okulara imaju ulogu da još više povećaju
sliku predmeta koju daje objektiv.
Moderni svjetlosni mikroskopi mogu postići povećanje od 1.000-3.000
x te omogućavaju oku da razluči objekte koji su međusobno udaljeni i do
0,0002 mm. Kaže se da je moć razlučivanja svjetlosnog mikroskopa koji koristi
vidljivi dio spektra 0,2 mm (mm - mikrometar, 1 mm = 10-6 m). Kod mikroskopa
koji koriste ultraljubičasti dio spektra mogu se razlučiti strukture koje
su međusobno udaljene i do 0,1 mm. U nastojanju da se postigne bolje razlučivanje
i na taj način omogući promatranje još sitnijih struktura, utvrđeno je
da moć razlučivanja mikroskopa nije ograničena samo brojem i kvalitetom
leća, već također i valnom duljinom svjetlosti koja se koristi za osvjetljavanje
promatranog objekta.
Dvadesetih godina prošlog stoljeća otkriveno je da se ubrzani elektroni u vakuumu ponašaju poput zraka svjetlosti, odnosno da imaju svojstva vala. Oni se kreću pravocrtno i njihova je duljina vala oko 100.000 puta manja od duljine vala svjetlosti. Elektronski mikroskopi umjesto snopa svjetlosti koriste snop elektrona - mala duljina vala elektrona omogućava im da postignu mnogo bolju moć razlučivanja. 1924. godine H. Bosch je pokazao da električno i magnetsko polje djeluju na elektrone na isti način kao što staklene leće djeluju na svjetlost. Ove karakteristike snopa elektrona omogućile su da dr. Ernst Ruska s Berlinskog Sveučilišta 1931. godine konstruira prvi elektronski mikroskop (tzv. transmisijski elektronski mikroskop). Dr. Ruska je za svoj rad na ovom području dobio Nobelovu nagradu za fiziku tek 1986. godine. Od konstrukcije prvog transmisijskog elektronskog mikroskopa koji je imao mogućnost povećanja od samo 17 puta, elektronska optika se brzo usavršavala i mogućnosti mikroskopa postajale su sve veće. Današnji elektronski mikroskopi postižu moć razlučivanja od 0,1 nm (nm - nanometar; 1 nm = 10-9 m) i povećanje od čak 1.000.000 puta. Ovi su složeni instrumenti omogućili da zavirimo u svijet unutar stanica živih bića, da upoznamo građu bakterija i virusa, pa čak i da vidimo molekulu deoksiribonukleinske kiseline (DNK).
Razlikujemo dva osnovna tipa elektronskih mikroskopa - transmisijski
elektronski mikroskop (TEM) i pretražni elektronski mikroskop (engl. scanning
electron microscope - SEM).
Kao što smo spomenuli, u elektronskom mikroskopu umjesto svjetlosti
na objekt koji promatramo pada snop elektrona. Put zraka elektrona i raspored
njegovih leća u osnovi je sličan onome kod svjetlosnog mikroskopa. Međutim,
umjesto izvora svjetlosti u elektronskom mikroskopu postoji izvor elektrona,
a umjesto staklenih leća za sabiranje ili rasipanje zraka elektrona koriste
se tzv. elektronske leće. Elektronska leća može djelovati na snop elektrona
pomoću električnog polja pa se takva leća naziva elektrostatska leća, ili
pomoću magnetskog polja te je u tom slučaju zovemo magnetskom lećom. Kod
elektrostatskih leća električno polje stvara nabijeni prstenasti kondenzator,
dok se kod magnetskih leća magnetsko polje stvara oko zavojnice kojom teče
struja.
Kako je građen transmisijski elektronski mikroskop? Kao izvor elektrona
u elektronskom mikroskopu služi tzv. elektronski top. Elektronski top građen
je od skupa elektroda (katoda i anoda) koje stvaraju uzak snop elektrona
podjednake brzine. Razlika potencijala između katode i anode vrlo je velika
i obično iznosi između 20.000 i 100.000 volti. Elektroni se izbijaju iz
katode udarcima pozitivnih iona ili žarenjem (pri tome se obično koristi
užarena volframova nit). Pozitivno nabijena elektroda, anoda, privlači
elektrone i propušta ih kroz središnji otvor. Elektronske leće koje imaju
ulogu kondenzora sabiru snop elektrona na predmetu koji promatramo. Sljedeća
elektronska leća ima ulogu objektiva i stvara prvu povećanu sliku predmeta.
Ostale leće služe samo da povećaju sliku koju daju leće objektiva i da
ju projiciraju na ekran. Zbog toga se nazivaju projekcione leće. Svi dijelovi
mikroskopa kroz koje prolazi snop elektrona nalaze se u vrlo visokom vakuumu,
jer bi čestice zraka mogle zaustaviti ili usporiti kretanje elektrona.
Ljudsko oko nije osjetljivo na elektrone kao što je na svjetlost. Zbog
toga se konačna slika predmeta projicira na zaslon koji je prevučen tzv.
fluorescentnim kemikalijama kao što su sulfidi cinka ili kadmija. Takve
tvari emitiraju svjetlost proporcionalno broju elektrona koji padne na
njih.
Kako nastaje slika u transmisijskom elektronskom mikroskopu? Pri izlaganju
uzorka snopu elektrona nastaju dvije osnovne pojave koje su važne za nastanak
slike: elektroni prolaze kroz uzorak (zbog toga uzorak mora biti vrlo tanak)
ili se na njemu raspršuju u različitim smjerovima. Dijelovi uzorka koji
su deblji ili veće gustoće općenito će raspršiti više elektrona nego tanji
uzorci ili uzorci manje gustoće. Ova pojava raspršenja snopa elektrona
na uzorku omogućava stvaranje kontrasta na elektronsko-mikroskopskoj slici.
Biološki uzorci su slabo kontrastni budući da sadrže uglavnom atome lakih
elemenata kao što su ugljik, vodik, kisik, dušik itd. Zbog toga, da bi
se povećao njihov kontrast, u uzorak se moraju uvesti atomi teških elemenata
kao što je to primjerice olovo.
Koji je princip rada pretražnih elektronskih mikroskopa? Kod ovog tipa
mikroskopa na uzorak se projicira uzak snop elektrona koji se pomiče (pretražuje)
po njegovoj površini. Pri tome može doći do raspršivanja elektrona na uzorku
ili stvaranja tzv. sekundarnih elektrona (elektroni koji se emitiraju s
površine uzorka). Ovi raspršeni i sekundarni elektroni se zatim sakupljaju
i detektiraju pomoću posebnog elektroničkog uređaja. Pri tome svakom pretraženom
dijelu uzorka odgovara jedna točka na ekranu; što veći broj elektrona uređaj
detektira, točka je svijetlija. Kako snop elektrona prelazi preko uzorka,
na ekranu se stvara slika predmeta sastavljena od mnoštva točaka. Pretražni
elektronski mikroskopi koriste se za istraživanje površina oni stvaraju
detaljnu i realističnu trodimenzionalnu sliku površine objekta koji promatramo.
Danas postoje različiti tipovi elektronskih mikroskopa sa vrlo velikim
mogućnostima. Tako primjerice pretražno-transmisijski elektronski mikroskopi
(engl. scanning transmission electron microscope - STEM) imaju karakteristike
SEM i TEM tipa mikroskopa. Neki elektronski mikroskopi imaju mogućnost
analize spektra rendgenskih zraka koje emitira uzorak kada na njega padne
snop elektrona. Budući da atomi različitih elemenata emitiraju karakterističan
spektar rendgenskog zračenja, pomoću analize njihovog spektra može se odrediti
o kojem se elementu radi. Na taj način možemo dobiti ne samo povećanu sliku
predmeta, već također saznati o kemijskom sastavu uzorka.
Mr. Tatjana Prebeg
Institut Ruđer Bošković