Pitanje je tek naizgled jednostavno. Nije jasno želite li životinje uzimati iz kopnenih voda u koje se ulijevaju otpadne vode ili želite uzeti uzorke otpadnih voda i tretirati organizme u laboratoriju. Oba pristupa imaju različitu metodologiju. Upotreba puževa i mikroorganizama (kojih?) također zahtijeva potpuno drugačije pristupe, a izbor metode koju ćete upotrijebiti za analizu toksičnosti otpadnih voda ovisiti će i o vrsti otpadnih voda (organski otpad, naftni derivati, pesticidi ). Stoga mislim da neće biti naodmet ako počnemo ispočetka.
Zbog ogromnog napretka u poljoprivredi i industriji u zadnjih 60 godina, organizmi su danas suočeni s mnoštvom promjena u okolišu kakve nisu susreli tijekom svoje evolucije. Takve promjene uključuju teške metale, pesticide, razna zagađivala te uništavanje prirodnih staništa odnosno njihovu promjenu (u salinitetu, temperaturi i dr.). Broj takvih promjena u okolišu broji se u tisućama. Svaki pokušaj da se analizira pojedinačno djelovanje čak i malog broja ovih stresora u prirodnim populacijama ekonomski je i tehnološki sve teži. Sve je izraženija potreba za razvojem brzih i preciznih metoda za što raniju detekciju početnih promjena u ekosistemima uzrokovanih zagađenjem. Ta se potreba može usporediti s uspješnim razvojem metoda za ranu detekciju mnogih ljudskih bolesti.
Danas postoji ogroman broj metoda za analizu stupnja zagađenja okoliša
odnosno kvalitete voda. Djelovanje polutanata na živuće organizme može
se procijeniti na raznim razinama biološke organizacije (molekularnoj,
staničnoj, na razini organizma, populacije, zajednice). Niti jedna metoda
nije univerzalna i zbog toga se metode moraju nadopunjavati. To uključuje,
osim analiza kvantitativnih i kvalitativnih promjena u prirodnom staništu
i laboratorijske eksperimente.
Vaše pitanje se odnosi na puževe (koji spadaju u skupinu mekušaca)
i na mikroorganizme pa ćemo stoga pokušati dati i zasebne odgovore.
MEKUŠCI (koljeno mekušci)
Od svih makroavertebrata mekušci su (posebice školjkaši) možda najčešće bili upotrebljavani kao biološki indikatori zagađenja. Razlog tomu je što su mekušci sjedilački organizmi (slabo pokretni ili nepokretni) koji akumuliraju u svoje tkivo mnoge ksenobiotike: pesticide, ugljikovodike, metale i druge tvari prisutne u vodi koja ih okružuje. Mekušci kao i ostali makroavertebrati imaju široko geografsko rasprostranjenje i tako omogućuju praćenje kvalitete gotovo svih voda.
I barski puževi su upotrebljavani u ispitivanju toksičnosti otpadnih
voda, za programe monitoringa i procjenu bioloških učinaka polutanata.
U znanstvenoj literaturi postoji velik broj najraznolikijih metoda (koje
se provode na raznim razinama biološke organizacije) koje su rabile ove
životinje u ispitivanjima toksičnosti otpadnih voda i mnogih kemijskih
spojeva (pesticida, teških metala
). U daljnjem tekstu navest ću samo neke
metode u kojima se koriste puževi i koje se danas najviše upotrebljavaju.
Većina dosadašnjih metoda koje su se najviše koristile za biološko
detektiranje onečišćenja okoliša uvelike su se oslanjale na mjerenja parametara
životnog ciklusa životinja kao što su preživljavanje (mortalitet), razmnožavanje
i razvoj (malformacije i brzina razvoja). Osim toga učinci antropogenih
sredstava najčešće su kvantificirani i mjerenjem njihove toksičnosti pomoću
testova toksičnosti, mutagenosti i karcinogenosti. U akvatičkim testovima
toksičnosti utvrđuju se koncentracije ispitivanih tvari koje izazivaju
ugibanje (LC50) ili neku vidljivu promjenu (EC50) u/na 50% svih promatranih
jedinki. Test se postavlja tako da se grupe organizama određene vrste izvrgavaju
progresivno sve većim koncentracijama toksikanata i da se istovremeno prati
određena reakcija koja se može lako kvantificirati. Takvi testovi mogu
biti kratkog (48, 96 sati), srednjeg i dugog trajanja što ovisi o životnom
vijeku promatrane životinje. Primjenom ovih testova najčešće se otkrivaju
promjene čije su posljedice većinom katastrofalne za biocenoze i ekosisteme.
Onečišćenje voda često je vidljivo tek nakon velikih promjena u populacijama
vodenih organizama kao što su masovna ugibanja i promjene u sastavu vrsta
u biocenozama. Želimo li spriječiti i izbjeći takve događaje onda se stupanj
rizika oštećenja vodenih biocenoza mora utvrditi znatno ranije kako bi
se takvi događaji mogli predvidjeti. Za takve analize, od svih metoda koje
su nam danas na raspolaganju, najviše obećavaju metode koje detektiraju
molekularne i stanične promjene koje upućuju na izloženost i/ili oštećenje
izazvano onečišćenjem okoliša. Drugim riječima reakcije na okolišni stres
započinju na biokemijskoj i fiziološkoj razini koje su tako najosjetljiviji
indikatori zdravlja životinja i trebali bi pružiti najranije moguće upozorenje
o predstojećim promjenama koje mogu dovesti do oštećenja stanica i patoloških
promjena te pogoršanja zdravlja promatrane populacije i biocenoze u cijelosti.
Kontaminanti akumulirani u tkivu mekušaca mogu prouzročiti stres koji
će izazvati promjene u njihovoj fiziologiji. Za određivanje tog stresa
predložena je uporaba "indikatora (pokazatelja) stresa". Stres je definiran
kao mjerljiva promjena stabilnog stanja izazvana promjenom u okolišu koja
čini jedinku (ili populaciju) ranjivijom prema daljnjim promjenama u okolišu.
Ove promjene se mogu kvantificirati mjereći vrijednosti bioloških parametara
(indikatori stresa) čije vrijednosti mogu biti upotrijebljene za vrednovanje
fiziološkog statusa životinja. Određeni su parametri čije promjene se mogu
pripisati općenitom fiziološkom stanju životinje (nespecifični ili općeniti
indikatori stresa) i ostali koji mogu pokazati djelovanje određenih grupa
zagađivala (specifični ili određeni indikatori stresa). Promjene ovih parametara
mogu dati informacije o sindromu stresa u životinjama i njihovim posljedicama
na razini populacije. Određivanje fiziološke kondicije životinja pomoću
općenitih indikatora stresa omogućiti će identifikaciju zagađenih područja
i kvantifikaciju negativnog učinka zagađenja na organizme. Specifični indikatori
stresa pružiti će informaciju o vrsti zagađivala odgovornoj za sindrom
stresa u životinje. Moramo napomenuti da je ova podjela ipak okvirna.
NESPECIFIČNI - OPĆENITI INDIKATORI STRESA
Otkrivaju nespecifičnu reakciju (sindrom stresa) životinje na širok opseg okolišnih stresora koji uključuje polutante i prirodne fizikalne i biološke faktore (npr. promjene u temperaturi, kisiku, salinitetu, prisustvu hrane i dr.) te na taj način daju uvid u sveukupno djelovanje promjena u okolišu na životinju i upotpunjuju više specifične odgovore na staničnoj razini.
ANATOMIJA I MORFOLOGIJA - Smanjenje učinkovitosti homeostatskih
mehanizama može rezultirati mnogobrojnim promjenama u fenotipu populacije.
Te promjene se mogu detektirati analizirajući promjene u izgledu životinja
(simetrija, bilateralna i radijalna, razni deformiteti u razvoju i dr.).
U ovu kategoriju možemo uključiti i mjerenja broja i veličine mrijestova,
te jaja položenih u njih. Tu se koriste i fiziološka mjerenja kao što su
hranjenje (primjerice: koliko su salate pojeli puževi), respiracija i ekskrecija
da bi se dobio uvid u proces rasta životinja.
IMUNOLOGIJA - Moguće je otkriti promjene u aktivnosti
imunološkog sustava kroz promjene u klasičnim imunološkim parametrima i
indeksima kao što su: krvna slika (ukupna i diferencijalna krvna slika),
produkcija antitjela i dr. Imunološki sustav je najnestabilniji sustav
u organizmu. Stoga će svaka promjena u okolišu rezultirati u promjeni funkcionalne
aktivnosti imunokompetentnih stanica i u imunodeficijenciji. Poznato je
da hemociti (krvne stanice mekušaca) imaju sposobnost fagocitiranja stranih
čestica (primjerice: bakterija) pa se i ta sposobnost može upotrijebiti
kao specifičan test.
HISTOLOŠKE (HISTOPATOLOŠKE) PROMJENE - Histopatologija
je znanost koja proučava vidljive promjene normalnog tkiva i često
se koristi u monitoringu zdravlja organizama. Neke promjene u okolišu mogu
dovesti do stresova koji će uzrokovati varijacije ili promjene u raznim
organskim sustavima a javljaju se kao posljedica patoloških promjena na
staničnoj i tkivnoj razini. Te promjene se detektiraju raznim histološkim
metodama. Ovdje možemo ubrojiti i promjene lizosomskog sustava. Lizosomski
sustav mekušaca vrlo je osjetljiv na djelovanje ksenobiotika a posebice
metala. Ovi stanični organeli sposobni su apsorbirati i akumulirati mnoštvo
različitih tvari, koje tada oštećuju njihove funkcije i tako dovode do
promjena u stabilnosti njihove membrane. Ove promjene mogu uzrokovati povećanje
volumena lizosoma, akumulaciju lipida i lipofuscina (pigment starenja i
stresa) u lizosomima, destabilizaciju lizosomalne membrane koja uzrokuje
nepravilnosti u obavljanju njihove funkcije i inhibiciju lizosomske protonske
pumpe. Porast propusnosti lizosomalne membrane je najbolje dokumentirana
reakcija na širok opseg okolišnih stimulansa i polutanata. To se može mjeriti
u probavnoj žlijezdi ili hemocitima puževa. Labilizacijski period je kraći
za životinje pod stresom. Destabilizacija lizosomskih membrana najčešće
je izazvana djelovanjem slobodnih radikala. Slobodni radikali (kisika)
stvaraju se tokom normalnog metabolizma u svih aerobnih organizama. Oni
se istovremeno uklanjaju antioksidativnom obranom (enzimi i vitamini).
No utjecajem ksenobiotika (klorirani ugljikohidrati, TCDD, DDT, poliklorirani
bifenili (PCB), metali i dr.), hipoksijom, ionizacijom, radijacijom i dr.
dolazi do povećane generacije oksiradikala. Ti radikali i njihovi derivati
oštećuju vitalne funkcije organizma: inaktiviraju enzime, oštećuju nukleinske
kiseline, degradiraju biopolimere, povećavaju propusnost membrana. Lipidi
bioloških membrana posebno se lako oštete oksidativnim djelovanjem pri
čemu dolazi do lipidne peroksidacije. Lipidna peroksidacija jedan je od
primarnih mehanizama kojim mnogi ksenobiotici oštećuju stanice a postoji
i nešto složenija biokemijska metoda za analizu mjerenje količine lipidne
peroksidacije u tkivu mekušaca.
Količinu superoksidnih radikala u organizmu kontrolira i enzim superoksid
dismutaza (SOD) i još neki drugi enzimi ili spojevi čija se količina u
organizmu može mjeriti. Organizam pod oksidativnim stresom, koji je u neravnoteži
između stvaranja oksiradikala i antioksidativne obrane, pokušava kompenzirati
situaciju povisujući aktivnost SOD.
MEHANIZAM MULTIKSENOBIOTIČKE OTPORNOSTI (engl. multixenobiotic
resistance MXR) Sve stanice posjeduju glikoproteinske pumpe smještene
u staničnoj membrani koje iz stanice izbacuju njima (organizmu) nepoznate
(potencijalno toksične) tvari ili tvari u suvišku. Prisutnost glikoproteinske
pumpe i funkcija mehanizma MXR direktno je proporcionalna razini onečišćenja
i dokazuje se biokemijskim i molekularno-biološkim metodama (Sauerborn
i Smital 1998).
SPECIFIČNI INDIKATORI STRESA
Odražavaju reakcije životinja na određene grupe zagađivala (teški metali,
organski ksenobiotici i dr.).
METALOTIONEINI - Metalotioneini su topivi, termostabilni
proteini male molekularne mase koji imaju veliki afinitet prema kationima
teških metala. Glavna uloga metalotioneina je da štite stanične strukture
od nespecifičnih reakcija (toksičnog učinka) s kationima teških metala
vežući ih na sebe i istovremeno detoksificirajući suvišak metala koji je
ušao u stanicu. Mjeri se količina metalotioneina u tkivu mekušaca.
OKSIGENAZE MJEŠOVITIH FUNKCIJA (OMF) - Mjerenje aktivnosti
monooksigenaza i koncentracije citokroma P450, metode su koje se već dulje
vrijeme rutinski upotrebljavaju u ekološkim istraživanjima. Oksigenaze
mješovitih funkcija (engl. mixed function oxygenases) su multienzimatski
sistem koji je prvi puta opisan u glatkom endoplazmatskom retikulumu stanica
sisavaca. One metaboliziraju endogene tvari (npr. steroidne hormone) i
lipofilne organske ksenobiotike (npr. policikličke ugljikovodike i pesticide
i dr.) u produkte koji su lakše topivi u vodi te se kasnije mogu konjugirati
(vezati) s raznim tvarima u citosolu i na taj način izlučiti iz stanice
i organizma. Ove karakteristike čine sistem OMF pogodnim specifičnim indikatorom
stresa za zagađenje organskim ksenobioticima jer se koncentracija/aktivnost
tih enzima u stanicama povećava proporcionalno staničnoj koncentraciji
raznih organskih ksenobiotika. Koncentracija citokroma P450 mjeri se najčešće
u probavnoj žlijezdi mekušaca.
GENETIČKE METODE
Citogenetička stabilnost je integralni dio homeostaze svake jedinke.
Čak i pod optimalnim uvjetima neke stanice spontano razvijaju kromosomske
abnormalnosti no učestalost takvih promjena u broju i strukturi kromosoma
je obično mala. Normalno, stanice s kromosomalnim promjenama se eliminiraju.
Te stanice umiru jer nemogu obavljati vitalne funkcije (sinteza proteina,
dioba i dr.) ili su eliminirane od strane imunokompetentnih stanica. U
normalnim uvjetima većina genetskih promjena se eliminira iz populacije
pomoću imunološkog (obrambenog) sustava organizma no dodatni stresovi mogu
biti prejaki za imunološki sustav što rezultira povećanjem oštećenja na
molekularnoj razini i kromosomima.
MIKRONUKLEUS TEST - Mikronukleus je citoplazmatski kromatin
koji je vidljiv u stanici kao mala jezgra pored normalne jezgre. Stvara
se od zaostalih kromosoma prilikom oštećenja mitotičkog mehanizma ili od
acentričnih kromosomskih fragmenata kod oštećenja kromosomskih struktura.
Porast broja mikronukleusa broji se u stanicama škrga ili, ako se radi
o pužu plućnjaku (kao što je to barski puž) u hemocitima.
ALKALNO ODMATANJE - Princip te metode se bazira na činjenici
da se dvostruka zavojnica DNA počinje odmatati pri izlaganju alkalnoj sredini
(pH>11.8). Količina odmotane DNA ovisiti će o oštećenju DNA.
COMET TEST Mikrogel elektroforeza jezgara bilo koje
vrste stanica. Ukoliko su prisutni lomovi DNA (jednostruki i/ili dvostruki)
"rep" komete će biti veći i ispunjeniji sitnim dijelovima DNA koji migriraju
prema anodi.
Ostale genetičke metode se rabe nešto rjeđe zbog male veličine kromosoma
u puževa:
ANEUPLOIDIJA - Aneuploidija je promjena u broju kromosoma
(povećanje ili smanjenje) koja zahvaća pojedine kromosome u kromosomskom
setu (2n-1, 2n+1), a koja nastaje zbog grešaka kod diobe stanica (mitozi
ili mejozi).
IZMJENA SESTRINSKIH KROMATIDA (ISK) - Izmjena sestrinskih
kromatida (engl. sister chromatide exchange - SCE) je rezultat rekombinacije
između homolognih područja na sestrinskim kromatidama.
KROMOSOMSKE ABERACIJE - To su promjene u strukturi kromosoma
nastale zbog oštećenja DNA kod nepravilnosti u mehanizmima za popravak
DNA ili njegovim potpunim izostankom.
MIKROORGANIZMI
Pod mikrorganizmima znanstvenici danas podrazumijevaju jednostanične
oblike biljaka i životinja koji su zapravo zasebni, samostalni životni
oblici što se ne mogu vidjeti golim okom. Često se mikroorganizmi ubrajaju
u posebno carstvo protista, a ono se nadalje dijeli u skupine nižih protista
(bakterije, cijanobakterije) i viših protista (alge, gljive, praživotinje)(Stilinović
1995).
STANDARDNE MIKROBIOLOŠKE ANALIZE mogu dati vrlo vrijedne
informacije o zagađenosti voda. Postoje metode koje se upotrebljavaju u
laboratorijima za određivanje mikrobioloških pokazatelja, a to su: broj
živih heterotrofnih bakterija, ukupan broj mikroorganizama, najvjerojatniji
broj mikroorganizama, broj koliformnih bakterija, patogene bakterije, enterovirusi.
Te metode nam govore o organskom onečišćenju otpadnih voda.
TEST KVAŠČEVIH GLJIVICA Saccharomyces cerevisae (eng.
Yeast Toxicity Test, YTT) Metoda YTT osniva se na činjenici da kvasac
može fermentirati saharozu do ugljikova (IV) oksida. Ako se uz saharozu
u uzorku nalazi tvar koja će djelovati na kvasac i sprječavati fermentaciju,
količina nastalog CO2 u usporedbi s kontrolnim uzorkom bit će smanjena,
ili CO2 uopće neće nastati. Sam se postupak provodi tako da se najprije
steriliziraju hermetički zatvorene bočice u kojima se nalazi hranjiva podloga
s agarom. Nakon toga se u bočice, pomoću štrcaljke i igle za ispuštanje
zraka, dodaju unaprijed pripremljena razrjeđenja otpadne vode i suspenzije
kvasca. Bočice moraju biti potpuno ispunjene tekućinom. Nakon toga se postave
graduirani injekcijski cilindri bez klipa i bočice potom inkubiraju u termostatu
na 28oC. Pošto istekne vrijeme inkubacije od 24 sata, očita se obujam nastalog
plina tako da se očita obujam istisnute tekućine iz bočice (Dvoraček i
Stilinović 1998).
DEHIDROGENAZNA AKTIVNOST MIKROORGANIZAMA POMOĆU TTC TESTA
Mjeri se aktivnost dehidrogenaza u mješovitoj bakterijskoj kulturi (aktivni
mulj), uz dodatak indikatora 2,3,5-trifeniltetrazolijeva klorida (TTC).
Brzina ili stupanj potrošnje kisika jest mjerilo aktivnosti organizma.
Iz toga izlazi da bi se brzina oslobađanja vodikovih iona mogla upotrijebiti
kao mjera metaboličke aktivnosti u aerobnom sustavu. Za svaku molekulu
potrošenog kisika dva se atoma vodika oslobađaju iz oksidiranog organskog
spoja meta. Na taj je način alternativa mjerenju potrošenog kisika mjerenje
oslobođenog vodika. Kao akceptor vodika služi TTC, koji je u oksidiranom
stanju bezbojan i njegovom redukcijom nastaje trifenil-formazan (TPF)
koji je crvene boje a nakon njegove ekstrakcije iz medija pomoću etanola,
jačina obojenja (odnosno dehidrogenazna aktivnost mikroorganizama) očita
se na spektrofotometru (Dvoraček i Stilinović 1998).
O testovima toksičnosti na mikroorganizmima je već
pisano u e-školi
Iako mnoštvo metoda nisam spomenuo u ovom tekstu mislim da sam dotaknuo
one trenutno najaktualnije. Nabrojene metode većinom su prekomplicirane
ili zahtijevaju sprave i pomagala koja su vam nedostupna no nemojte da
vas to obeshrabri. Vama bih preporučio slijedeće metode: bilježenje broja
i veličine mrijestova puževa te broja jaja u njima, brojanje ukupnog broja
hemocita u krvi (hemolimfi) puževa, testiranje destabilizacije lizosomske
membrane u hemocita pomoću boje neutralnog crvenila, brojanje mikronukleusa
u hemocitima i test kvaščevih gljivica.
Ako niste odustali od vaše želje možete mi se obratiti za savjet kako izvesti jedan (ili više) od navedenih ili nenavedenih (vaše ideje) testova primjerenih mogućnostima vašeg laboratorija.
LITERATURA:
mr. Goran Klobučar
Zoologijski zavod, Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb
gklobuca@public.srce.hr
E-školaŠ u suradnji
s om.
Održava Toni
Nikolić . Posljednje promjene 26. listopad 1999.