Odgovori na postavljena pitanja - Biologija
Lektini su proteini ili glikoproteini, uglavnom biljnog podrijetla. Djelovanja su im različita, primjerice poticanje stanične diobe, aglutinacija eritrocita i dr. Mnoge
biljke sadrže visoke koncentracije lektina u sjemenkama, zbog čega su neke izuzetno otrovne.
Od lektina koji utječu na diobu bijelih krvnih stanica najpoznatiji su konkavalin A (Concavalin A; Con A) iz sjemenki biljke Canavalia ensiformis, te
fitohemaglutinin (Phytohaemagglutinin; PHA) iz Phaseolus spp. koji potiču diobu T-limfocita.
Na poticanju diobe limfocita periferne krvi zasniva se čitav niz laboratorijskih testova. Primjena tih testova je višestruka i uključuje različita područja istraživanja.
Primjerice: testiranje različitih fizikalnih i kemijskih mutagena u uvjetima in vitro, citogenetički biomonitoring populacija izloženih mutagenima iz životnog i radnog
okoliša, citogenetička testiranja koja se provode u dijagnostičke svrhe (dijagnostika različitih, a osobito zloćudnih bolesti) i sl.
Najpoznatiji testovi koji se zasnivaju na diobi limfocita u uvjetima in vitro su test analize strukturnih aberacija kromosoma, test izmjene sestrinskih kromatida i
mikronukleus test. Ovi testovi uključuju 48-, odnosno 72-satno kultiviranje krvi u kontroliranim uvjetima in vitro. Uzorci krvi nasađuju se u hranjivu podlogu, koja
sadrži potrebne mikronutrijente neophodne za rast stanica, te različite druge specifične sastojke (ovisno o metodi). Postupci izrade preparata koji se
mikroskopski analiziraju također su ovisni o metodi. Primjerice, ako nam je cilj proučiti strukturna oštećenja kromosoma, potrebno je dobiti što veći broj stanica
u metafazi, pa se zadnja 2-3 sata u kulture dodaje inhibitor diobenog vretena (kolhicin). Po završetku kultiviranja stanica pristupa se izradi preparata, koja
uključuje obradu hipotoničnom otopinom, fiksiranje taloga (3:1 metanol - ledena octena kiselina) te niz uzastopnih centrifugiranja i ispiranja taloga. Naposljetku
ostaje pročišćena suspenzija limfocita koja se nakapava na predmetna stakalca, a ona se nakon sušenja na zraku boje (najčešće Giemsa bojom). Dobiveni
se preparati mikroskopski analiziraju. Gotovi preparati nakon sušenja mogu se obraditi i prema drugim specifičnim protokolima, primjerice obojiti fluorescentnim
bojama, otopinom srebro-nitrata, podvrgnuti nekoj od tehnika pruganja kromosoma ili fluorescencijskoj in situ hibridizaciji (tzv. FISH), koja omogućuje otkrivanje
vrlo specifičnih oštećenja na kromosomima.
Teško mi je dati konkretan odgovor o metodologiji jer ne znam što biste zapravo htjeli istraživati i kakve su Vam tehničke i financijske mogućnosti. Uzgoj
staničnih kultura zahtijeva posebno prilagođen i opremljen laboratorij. Metodologija nije komplicirana, a za sve testove danas postoje vrlo egzaktni protokoli.
Hranjive podloge možete pripremiti sami ili možete nabaviti gotove hranjive podloge u koje se samo nasadi odgovarajući volumen krvi. Ukoliko sami
pripremate hranjivu podlogu, morate nabaviti različite sastojke (praškastu hranjivu podlogu, serum, antibiotike, neki stimulator rasta (najčešće fitohemaglutinin,
npr. proizvođača Murex Biotech Ltd.)). Takva priprema nije financijski isplativa ako radite na malom broju uzoraka. Za tehnike bojenja također postoje protokoli,
te gotove boje i različiti "kitovi" koji sadrže sve potrebne otopine i upute za rad.
Prilažem neke od dokumenata koji bi Vam mogli biti korisni.
Dr. sc. Nevenka Kopjar
voditelj Laboratorija za mutagenezu i kancerogenezu
Institut za medicinska istraživanja, Zagreb