Odgovori na postavljena pitanja - Biologija

Najvažniji testovi u biokemijskoj seriji za determinaciju koliformnih bakterija su indol, metil crveno, Voges-Proskauer i citrat. Ovi se testovi skraćeno nazivaju IMViC-reakcije ili IMViC-formule. Na osnovu ovih reakcija brzo se može diferencirati E. coli (siguran indikator fekalne kontaminacije) od ostalih najučestalijih koliformnih bakterija u uzorku vode. Kao što je prikazano u tablici 1, Enterobacter aerogenes i Klebsiella pneumoniae imaju istu IMViC-formulu, no ove se vrste lako mogu razlikovati na osnovu određivanja pokretljivosti u dubokom polukrutom agaru. Vrste roda Enterobacter biti će pokretne, dok će Klebsiella vrste biti nepokretne.

Nadalje ćemo pojasniti izvedbu svakog pojedinog testa.

Dokazivanje indola

Za dokazivanje indola koristi se tekuća podloga bogata triptofanom (triptofan bujon):

Ukoliko bakterija posjeduje enzim triptofanazu može razgrađivati aminokiselinu triptofan do indola. Ukoliko je u epruveti stvoren indol nakon perioda inkubacije (35°C / 48 h), dodatkom Kovaczevog ili Erlichovog reagensa, indol će reagirati s aldehidnom skupinom p-dimetilaminobenzaldehida sadržanog u reagensu, pri čemu će tvoriti kompleks crvene boje.

Indol je topiv u organskim otapalima i butanol (amilni alkohol) sadržan u Kovacz-evom reagensu može ekstrahirati indol iz vodenog medija, te će isplivati na površinu tekućeg medija u obliku prstena. Koncentrirani ekstrahirani indol će u prstenu reagirati s reaktivnom komponentom p-dimetilaminobenzaldehidom, te će prsten biti obojen crveno. Ukoliko indol u epruveti nije stvoren, prsten će biti boje Kovacz-evog reagensa, tj. žuti. Erlich-ov reagens je osjetljiviji od Kovacz-evog, no prije korištenja potrebno je u epruvetu dodati par kapi nekog organskog otapala (npr. kloroform) koje će ekstrahirati indol iz vodenog medija.

Metilno crvenilo i Voges Proskauer test

Za izvođenje ovih testova koristi se metil crveno / Voges-Proskauer bujon sastava:

Bakterije mogu fermentirati glukozu mješovito-kiselim ili butilenglikolnim putem. U mješovito-kiselom putu fermentacije stvaraju se jake kiseline (jantarna, mliječna, mravlja, octena kiselina) koje su dovoljne da nadvladaju puferski sustav podloge pri produženoj inkubaciji (35°C / 48-72 h) i održavaju pH-vrijednost ispod 4,4. Metil crveno je kod pH 6,9 žute boje, a kod 4,4 i niže crvene boje. Stoga kad se u epruvetu nakon perioda inkubacije ukapa metil crveno, crvena boja u epruveti ukazati će da je metil crveno test pozitivan (npr. vrste roda Citrobacter, Escherichia), a žuta boja (npr. vrste roda Enterobacter, Klebsiella) da je test negativan. Pojava narančaste boje ukazuje da su u epruveti stvorene slabije kiseline, što nije dokaz pozitivnog testa.

U butilenglikolnom putu stvara se acetilmetilkarbinol (acetoin), a stvorena količina kiselina nije dovoljna za sniženje pH podloge na 4,4 (dokaz pozitivnog metil crveno testa). Stoga je najveći broj bakterija koje su u Voges-Proskauer testu pozitivne (Enterobacter, Klebsiella), negativne u metil ž crveno testu. Voges-Proskauer test provodi se u istoj epruveti kao i metil crveno test. Nakon perioda inkubacije (35°C / 48 h), 1 mL ili polovica volumena prenese se u novu sterilnu epruvetu. U epruvetu se doda Barrit-ov reagens (0,6 mL otopine α-naftola i potom 0,2 mL otopine KOH). Epruveta se protrese i ostavi izložena atmosferskom kisiku kroz 15 min. Acetoin u epruveti biti će preveden u diacetil u prisutnosti atmosferskog kisika i KOH, a katalitičkim djelovanjem α-naftola i kreatina diacetil će biti preveden u crveno obojeni kompleks. Ukoliko se sadržaj epruvete oboji crveno nakon 15 min od dodatka reagensa, Voges-Proskauer test je pozitivan.

Korištenje citrata na Simmons-ovom citratnom agaru

Ovaj se test koristi u svrhu ispitivanja mogućnosti pojedine bakterije da koristi Na-citrat kao jedini izvor ugljika. Na-citrat je sol limunske kiseline, jednostavan organski spoj koji je jedan od osnovnih metabolita u Krebsovom ciklusu (ciklusu trikarbonskih kiselina). Neke bakterije mogu dobivati energiju iskorištavanjem citrata kao jedinog izvora ugljika, za razliku od ostalih fermentacija organskih molekula. Određivanje iskorištavanja citrata važno je u identifikaciji mnogih predstavnika porodice Enterobacteriaceae. Podloge koje se koriste za test ne smiju sadržavati proteine i ugljikohidrate kao izvore ugljika. Najčešće upotrebljavana podloga za ispitivanje korištenja citrata je Simmons-ov citratni agar.

U podlozi se nalazi Na-citrat kao jedini izvor ugljika i amonij-fosfat kao jedini izvor dušika. Bakterije iskorištavanjem citrata stvaraju natrijevu lužinu, a paralelnim korištenjem dušika iz amonij-fosfata amonijevu lužinu. Stvorene lužine podižu pH vrijednost medija iznad 7,6, te bromtimol plavo prelazi iz zelene boje (pH 6,9) u modru. Ukoliko je nakon perioda inkubacije (35°C / 48 h) epruveta Simmonsov-og citratnog agara plave boje i vidi se porast kolonija na kosini agara test je pozitivan.

Dr. sc. Jasna Hrenović
viši asistent na Botaničkom zavodu
Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb